Как применяется ультрафиолетовая спектрофотометрия в фармакопейном анализе испытаний на количественное определение органических лекарственных веществ?

Спектрофотометрия в ультрафиолетовой области широко используется для количественного определения лекарственных веществ и их препаратов и включена во все современные фармакопеи.

Идеальное вещество для таких измерений должно иметь четко выраженную полосу поглощения с широким максимумом (для уменьшения ошибки за счет ширины щели) и со значительной величиной поглощения при максимуме.

Чувствительность анализа определяется в основном способностью вещества поглощать свет и выражается, как было указано выше, молярным коэффициентом поглощения. Предельные концентрации веществ, анализируемые при помощи спектрофотометрии, как правило, меньше, чем при обычных и потенциометрических титрованиях или весовых измерениях, что и объясняет тот факт, что спектрофотометрия используется при определении небольших количеств веществ.

Основным условием для количественного анализа является соблюдение закона Ламберта - Беера в пределах указанных концентраций. Для проверки соответствия закону строят график зависимости: поглощение - длина волны, если все точки лежат на прямой - закон выполняется. Точность метода будет зависеть от наклона прямой: чем больше наклон, тем выше точность.

По другому способу рассчитывают фактор для каждого стандартного раствора и определяют область концентраций, в пределах которой величина D/C остается постоянной.

Известны два принципиально различных способа спектрофотометрических количественных определений. По одному из них содержание вещества рассчитывают на основании предварительно вычисленной величины поглощения. Чаще всего в таких случаях используется значение Е (1%, 1 см) и закон Ламберта - Беера принимает следующую форму:

Британская фармакопея1968 г. приняла этот метод определения как для лекарственных веществ, так и для лекарственных форм.

Растворяют около 10 мг (точная навеска) в безводном спирте и доводят спиртом до 100 мл, разводят 5 мл полученного раствора до 50 мл безводном спиртом и измеряют поглощение полученного раствора в кювете с толщиной слоя 1 см при 240 нм Е (1%, 1 см) для С₂₀Н₃₀О₂ при максимуме около 240 ям - 535 (Метилтестостерэн).

Государственная фармакопея СССР X издания следующим образом рекомендует определять кортизона ацетат в таблетках.

Около 0,1 г (точная навеска) порошка растертых таблеток помещают в мерную колбу емкостью 100 мл с притертой пробкой, прибавляют 60-70 мл 95% спирта и растворяют при легком подогревании на водяной бане при помешивании в течение 10-15 минут. По охлаждении раствор доводят до метки 95% спиртом, хорошо перемешивают и дают отстояться в течение часа. Не взмучивая осадка, 5 мл раствора переносят в другую мерную колбу емкостью 100 мл и доводят тем же спиртом до метки. Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 238 нм в кювете с толщиной слоя в 1 см. В контрольную кювету помещают спирт.

Содержание кортизона ацетата в граммах вычисляют по формуле:

где D-оптическая плотность испытуемого раствора; 390 - удельный показатель поглощения кортизона ацетата; Е (1%, 1 см) при 238 нм; а - навеска препарата в граммах; б - средний вес таблетки в граммах.

Количественное определение по описанному выше методу подвергается постоянной критике. Основной причиной для этого является общеизвестный факт, что различные спектрофотометры (даже различные приборы одной и той же модели и одного производства) дают значительные отклонения по величине поглощения для одного и того же стандартного раствора.

Более правильным способом является сравнение поглощения испытуемого вещества с поглощением стандартного образца, определенного в тех же условиях. Таким образом достигается наибольшая точность, так как при этом учитываются многочисленные факторы, влияющие на спектрофотометрические измерения, как, например, установка длины волны, ширина щели, поглощение кюветы, поправки на поглощение растворителя и т. д.

Многие методы физико-химического анализа лекарственных средств связаны со сравнительной оценкой испытуемого препарата по отношению к веществам, химический состав которых отличается постоянством и может быть установлен с 'необходимой точностью. Такие вещества называют стандартными образцами. Выражение «стандарт» особенно часто применяется в биологических методах анализа. Однако в связи с тем, что термин одновременно применяют и для обозначения технической документации (ГОСТ), представляется более правильным называть все вещества, используемые для сравнения при определении качества, стандартными образцами.

Как вытекает из самого определения, вопросы чистоты вещества приобретают основное значение при разработке стандартных образцов. Некоторыми фармакопеями (Фармакопея США XVII) во всех случаях качественного или количественного спектрофотометрического определения рекомендуются специально приготовленные стандартные образцы, в связи с чем общее число таких веществ в Фармакопее США превышает 150. Однако число специально приготовленных стандартных образцов может быть ограничено за счет использования в качестве их веществ, отвечающих требованиям фармакопеи. Некоторые интересные принципиальные положения в этом отношении приняты Государственной фармакопеей СССР X издания, Международной фармакопеей Второго издания и Скандинавской фармакопеей.

В частности, при количественном спектрофотометрическом определении индивидуальных веществ эти фармакопеи рекомендуют применять специально приготовленные стандартные образцы. При расчете количественного содержания определяемого вещества по ГФХ и Международной фармакопее, если нет специального указания, стандартный образец принимают за 100%; по Скандинавской фармакопее учитывают фактическое содержание чистого вещества в стандартном образце, что, по-видимому, следует делать лишь при содержании чистого вещества ниже 97, например при анализе некоторых витаминных препаратов.

Следующий текст используется в статьях X издания Государственной фармакопеи при анализе индивидуальных веществ.

Измеряют оптическую плотность 0,001 % раствора препарата в 95% спирте на спектрофотометре при длине волны 241 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Повторяют такое же измерение с 0,001% раствором стандартного образца прегнина.

Содержание прегнинав процентах (X) вычисляют по формуле:

где D₁ - оптическая плотность испытуемого раствора; Do - оптическая плотность раствора стандартного образца; C₁ - концетрация испытуемого раствора; С₀ - концентрация раствора стандартного образца.

Содержание C₂₁H₂₈02 в препарате должно быть не менее 97% и не более 103,0% (Прегнин).

При количественном определении лекарственных форм, если нет специальных указаний, стандартным образцом служит вещество, отвечающее всем требованиям фармакопеи. При расчетах стандартный образец принимают за 100%. По Международной фармакопее при спектрофотометрическом анализе лекарственных форм в качестве стандартного вещества применяют вещество, определяемое но фармакопее объемным, весовым или другими, но не спектрофотометрическими методами. Так как в ряде случаев этого требования может быть недостаточно, во Второе издание Международной фармакопеи включена оговорка о возможном применении для анализа лекарственных форм специального стандартного образца.

Методика количественного определения дипрофиллина в таблетках дипрофиллина по ГФХ.

Около 0,12 г (точная навеска) порошка растертых таблеток помещают в мерную колбу емкостью 100 мл, прибавляют небольшое количество воды, доводят объем раствора водой до метки, перемешивают и фильтруют, 1 мл фильтрата переносят в мерную колбу емкостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 273 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Параллельно проводят измерение оптической плотности раствора стандартного образца дипрофиллина.

Содержание дипрофиллина в одной таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле:

где D₁ -- оптическая плотность испытуемого раствора; D₀ - оптическая плотность раствора стандартного образца; а-навеска в граммах; б - средний вес таблетки в граммах.

Содержание С₁₀Н₁₄О4 должно быть 0,19-0,21, считая на средний вес одной таблетки.

Примечание. Приготовление раствора стандартного образца дипрофиллина. 0,1000 г стандартного образца дипрофиллина растворяют в воде в мерной колбе емкостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки. 1 мл полученного раствора переносят в мерную колбу емкостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

1 мл раствора стандартного образца содержит 0,01 мг дипрофиллина.

Расчет содержания вещества по стандартам не представляет особых трудностей. Как правило, построение калибровочного графика не является необходимым, так как ультрафиолетовые измерения, выполненные на современных приборах, практически всегда следуют закону Ламберта - Беера и одно измерение стандартного и исследуемого вещества обеспечивает точные результаты. При текущем анализе желательно время от времени проверять поглощения стандартных растворов для предотвращения ошибки вследствие неожиданных изменений характеристики спектрофотометра.

Необходимо упомянуть способ расчета, принятый Скандинавской фармакопеей. Содержание вещества в испытуемом препарате определяютпо формуле:

где q - концентрация стандарта в миллиграммах на 100 мл раствора; п - процентное содержание чистого вещества в стандарте; р - концентрация испытуемого вещества в ми-лиграммах на 100 мл; K₁ - разница в поглощении стандартного раствора, измеренного к контрольному раствору; К₂ - разница в поглощении стандартного раствора, измеренного к испытуемому раствору.

Второе издание Международной фармакопеи не указывает способа расчета содержания вещества.

Рассчитывают содержание вещества по величине поглощения, полученной со стандартным образцом, определенной при условиях опыта.

Рассмотренные до сих пор методы спектрофотометрических количественных определений относились к анализу одного компонента при условии отсутствия поглощающих примесей в области максимума и при условии, когда расчет поправки на дополнительное поглощение не представляет специальной проблемы.

Однако поправку на примеси следует определять, если спектрофотометрически анализируются природные извлечения или сложные смеси. Существует несколько способов установления поправок в зависимости от характера кривой поглощения и примесей. Эти методы могут быть найдены в специальной литературе.

Один из них, известный под названием способа Мортон - Стаббса, используется в фармакопейном определении ретинола (витамина А). Линейная зависимость содержания поглощающих примесей по отношению к длине волны является основным условием для расчета поправки по способу Мортон - Стаббса. Поглощение измеряют в трех точках спектра таким образом, что второе измерение приходится на максимум поглощения. Остальные величины поглощения при двух длинах волн равны между собой и составляют определенную часть поглощения при максимуме; эта последняя рассчитывается по результатам, полученным для чистого вещества.